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O
sistema de Captura Híbrida® em microplaca é uma solução
hibridizadora que utiliza anticorpos na captura com amplificação
de sinal, sendo detectado pela quimioluminescência. Espécimes
contendo DNA, hibridizam-se com o coquetel de sondas específico de
RNA-HPV. O resultado dos híbridos RNA:DNA são capturados sobre a
superfície da microplaca recobertos com anticorpos específicos
para os híbridos RNA:DNA. A seguir faz-se a reação destes híbridos
imobilizados com conjugados de anticorpos específicos para híbridos
de RNA-DNA e fosfatase alcalina e, são detectados por um substrato
quimioluminescente. Várias moléculas de fosfatase alcalina são
conjugadas para cada anticorpo. Múltiplos anticorpos conjugados se
ligam em cada híbrido capturado. A luz emitida é medida como
unidade de luz relativa (RLU) no luminômetro. A intensidade de luz
emitida denota a presença ou ausência do DNA alvo nos espécimes.
A medida RLU igual ou acima que o Valor do Cutoff indica a presença
da seqüência específica de DNA-HPV no espécime. RLU menor que o
valor do Cutoff indica a ausência de DNA-HPV específico ou os níveis
de DNA HPV estão abaixo do limite de detecção do ensaio. A duração
de todo o teste é de seis horas
Dentro
da mesma plataforma de exame, trocando apenas as sondas, todos os
agentes podem ser detectados até 1 pg/ml = 0,1 cópia de DNA por célula
(em Microplaca). Todos os testes de Captura
Híbrida® são, ao mesmo tempo, Qualitativos
e Quantitativos.
Diferentemente
das outras técnicas que se utilizam da amplificação gênica, com
a Captura Híbrida® não se observa a existência de falso positivos
por contaminação. Além disso, sua reprodutibilidade inter-laboratorial
é de 98%.
A
Captura Híbrida® para HPV é capaz de detectar os 18 tipos de HPV
mais comuns, que infectam o trato ano-genital. O Grupo A possui
sondas para os HPV de baixo risco (6, 11, 42, 43 e 44) e, o Grupo B,
sondas para os HPV de intermediário/alto risco (16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68). Sua sensibilidade é de 1
pg/ml de DNA-HPV, equivalente a 0.1 cópia de vírus/célula. Por
essa sensibilidade, os estudos têm mostrado estreita relação
entre os resultados e a evolução clínica. Esses tipos representam
95% dos vírus que infectam o trato ano-genital, sendo que, os do
grupo intermediário/alto risco, estão presentes em 99% dos
casos.
Indica-se
esse método diagnóstico para:
-
Resultado
citológico de significado indeterminado (ASCUS);
-
Screening
primário associado ao Papanicolaou para mulheres com 30 anos ou
mais;
-
Acompanhamento
de pacientes com exame histopatológico classificado como lesão
de baixo grau;
-
Discordância
entre colposcopia, citologia e histopatologia;
-
Controle
pós-tratamento.
O
exame pode ser feito em material colhido por escova ou raspado. Biópsias
colhidas à fresco em corte transversal de até 5 mm, podem também
ser analisadas no teste DNA-HPV. A biópsia deve ser colocada
imediatamente dentro do Kit coletor da Digene e estocado no freezer
à -20 ºC. Biópsias podem ser armazenadas de 2 - 30ºC por somente
uma noite, passado este prazo, estocar à -20ºC até ser
transportado e processado.
Para
que se possa garantir a qualidade preconizada pela Digene do Brasil,
nosso laboratório, segue rigorosamente as seguintes normas técnicas:
-
Pipetas:
são aferidas anualmente, com material oferecido pelo fabricante.
-
Rotary
shaker: é aferido semestralmente com tacômetro.
-
Quimioluminômetro
(DML2000): é aferido semestralmente com uma placa própria
denominada"dinamic range"
Controle
de Qualidade: em cada teste os controles positivo e negativo são
processados em triplicata, de seus resultados calcula-se a média.
Os resultados dos Controles Positivos e Controles Negativos devem
mostrar coeficiente de variação (%CV) <25%. Se a %CV for
>25%, deve-se descartar o controle com valor do RLU que estiver
fora do limite, e recalcular a média usando os dois controles
restantes. Se a diferença entre a média de cada controle
(negativo, positivo A e positivo B) for considerado menor ou igual
à 25%, prosseguir para a próxima etapa, caso contrário, o teste
será considerado inválido e deverá ser repetido.
A
média dos resultados dos Controles Negativos deve ser menor
ou igual a 250 RLU. Se a média do controle Negativo for > 250
RLU, o teste será inválido e deverá ser repetido.
Os
resultados da média dos Controles Positivos (xCP) e a média dos
controles Negativos (xCN) são usados para calcular a relação da
xCP/xCN para cada sonda. Essas relações devem seguir os critérios
para validação do teste, antes dos resultados dos espécimes serem
interpretados:
XCPA/xCNA
>2,0
XPCB/xCNB
>2,0
Calcular
aproximadamente as relações xCP/xCN de cada set de sonda dos
controles. Se a relação for > 2,0, prosseguir para a próxima
fase. Se qualquer das relações falhar, o teste é inválido para o
set de sonda específico e deverá ser repetido.
Uma
vez validado o teste, o cálculo do cutoff para determinar os espécimes
é feito pela média dos controles.
Cutoff
da Sonda A = x PCA
Cutoff da Sonda B = x PCB
Todos
os valores de RLU dos espécimes devem ser convertidos dentro da
relação do Valor do Cutoff apropriado. Por exemplo, todos os
testes realizados com Sonda A para HPV devem ser expressados como
RLU do Espécime/Cutoff A. O mesmo pode ser feito com espécimes
testados com Sonda B para HPV.
O
critério para interpretação dos resultados do teste DNA-HPV é:
-
Espécimes
com relação RLU/Cutoff >1,0 da Sonda A para HPV são
considerados "positivos" para um ou mais tipos de HPV
6,11,42,43 ou 44
-
Espécimes
com relação RLU/Cutoff .1,0 da Sonda B são considerados
"positivos" para um ou mais tipos de HPV
16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 e 68
Como
controle trimestral é utilizado um Painel de Teste para DNA-HPV
composto de 6 amostras (uma negativa e cinco positivas) com
concentrações previamente conhecidas dos tipos de HPV, que são
detectados no teste DNA-HPV da Digene. Essas amostras são usadas
como controle interno do laboratório.
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informações contidas neste site não substituem a consulta
pessoalmente com um profissional médico.
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